Firma de citoquina asociada con la gravedad de la enfermedad en pacientes con síndrome de fatiga crónica

[trastevere]

Firma de citoquina asociada con la gravedad de la enfermedad en pacientes con síndrome de fatiga crónica

http://www.pnas.org/content/114/34/E7150

José G. Montoya , Tyson H. Holmes , Jill N. Anderson , Holden T. Maecker , Yael Rosenberg-Hasson , Ian J. Valencia , Lily Chu , Jarred W. Younger , Cristina M. Tato y Mark M. Davis

PNAS 22 de agosto de 2017. 114 (34) E7150-E7158; publicado antes de imprimir el 31 de julio de 2017. https://doi.org/10.1073/pnas.1710519114
Contribuido por Mark M. Davis, 28 de junio de 2017 (enviado para revisión el 16 de noviembre de 2016, revisado por Gordon Broderick, Ben Katz y Anthony L. Komaroff)

Significado
La encefalomielitis miálgica / síndrome de fatiga crónica (EM / SFC) devasta las vidas de millones de personas y sigue siendo una enfermedad misteriosa a pesar de décadas de investigación. Se sospecha desde hace tiempo que la inflamación es fundamental para su patogénesis. Aunque solo se encontraron dos citoquinas diferentes (TGF-β superior y resistina inferior) en pacientes con EM / SFC en comparación con los controles, 17 citoquinas se correlacionaron con la gravedad de la EM / SFC. Trece de estas citoquinas son proinflamatorias y pueden contribuir a muchos de los síntomas que estos pacientes experimentan durante varios años. Solo CXCL9 (MIG) se correlacionó inversamente con la duración de la fatiga.

Abstracto
Aunque se han informado anteriormente algunos signos de inflamación en pacientes con encefalomielitis miálgica o síndrome de fatiga crónica (EM / SFC), los datos son limitados y contradictorios. Los métodos de alto rendimiento ahora nos permiten interrogar al sistema inmune humano para detectar múltiples marcadores de inflamación a una escala que antes no era posible. Para determinar si una firma de citocinas séricas podría asociarse con EM / SFC y correlacionarse con la gravedad de la enfermedad y la duración de la fatiga, se midieron las citoquinas de 192 pacientes ME / SFC y 392 controles sanos usando una matriz de múltiplex 51 en un sistema Luminex. Los datos preprocesados ​​de cada citoquina se regresaron en la severidad ME / CFS más covariables para la edad, el sexo, la raza y una propiedad del ensayo de importancia recientemente descubierta: unión inespecífica. En promedio, TGF-β fue elevado ( P= 0.0052) y la resistina fue menor ( P = 0.0052) en pacientes en comparación con los controles. Diecisiete citocinas tuvieron una tendencia lineal ascendente estadísticamente significativa que se correlacionó con la gravedad de ME / CFS: CCL11 (Eotaxin-1), CXCL1 (GROα), CXCL10 (IP-10), IFN-γ, IL-4, IL-5, IL- 7, IL-12p70, IL-13, IL-17F, leptina, G-CSF, GM-CSF, LIF, NGF, SCF y TGF-α. De las 17 citocinas que se correlacionaron con la gravedad, 13 son proinflamatorias, lo que probablemente contribuye a muchos de los síntomas experimentados por los pacientes y establece un fuerte componente del sistema inmunitario de la enfermedad. Solo CXCL9 (MIG) se correlacionó inversamente con la duración de la fatiga.

La encefalomielitis miálgica o síndrome de fatiga crónica (EM / SFC) es una enfermedad compleja y debilitante de etiología desconocida que afecta a más de un millón de estadounidenses y millones de personas en todo el mundo ( 1 , 2 ). ME / CFS se caracteriza por fatiga persistente o recidivante inexplicable de duración al menos 6-mo que no se alivia con el reposo y resulta en una reducción sustancial en los niveles anteriores de ocupacional, educativo, social, y actividades personales ( 2 ⇓ ⇓ - 5) En los pacientes con EM / SFC, la fatiga es solo uno de los múltiples síntomas incapacitantes que incluyen deterioro cognitivo, malestar post-esfuerzo, sueño no reparador, dolores de cabeza, mialgias, artralgias, dolor de garganta, linfadenopatía, hipersensibilidad al ruido, luz o ciertos alimentos y trastornos autonómicos ( 4 ) Estos síntomas a menudo se agrupan en cada paciente en combinaciones e intensidad variables. "ME / CFS" ha sido el término generalmente preferido por los investigadores, pero los términos "encefalomielitis miálgica" (ME) o "síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune" (CFIDS) son preferidos por los médicos y pacientes, dada la amplia gama de quejas y la heterogeneidad de la enfermedad ( 1 , 4 , 6 , 7) En un informe reciente, el Instituto de Medicina propuso una nueva definición para ME / CFS y un nuevo nombre: "enfermedad por intolerancia al esfuerzo sistémico" (SEID) ( 2 ).

La presencia de síntomas pseudogripales continuos o fluctuantes, artralgias, mialgias, alteraciones autonómicas y una sorprendente hipersensibilidad a los estímulos en muchos pacientes con esta enfermedad ha llevado a sospechar que el EM / SFC es un trastorno inflamatorio o inmunológico ( 8 ). Sorprendentemente, los marcadores convencionales de inflamación comúnmente usados ​​en la práctica diaria de la medicina (p. Ej., Velocidad de sedimentación globular, proteína C-reactiva) rara vez son elevados en pacientes con EM / SFC ( 9 ). Las pruebas que miden la respuesta inmune innata y adaptativa se informaron como anormales, pero a menudo arrojan resultados negativos o contradictorios ( 8 , 10 ⇓ - 12) Sin embargo, en un estudio longitudinal, la gravedad de la fatiga se asoció con las fluctuaciones diarias de la adipocina leptina inflamatoria ( 13 ). Además, muchos estudios han encontrado un aumento en el número de células CD8 + citotóxicas circulantes portadoras de antígenos de activación ( 8 , 14 ⇓ - 16 ). Además, en un estudio transversal, Hornig et al. ( 17 ) informaron una firma inflamatoria de citoquina distinta asociada con la enfermedad temprana.

Un gran estudio epidemiológico informó un mayor riesgo de linfoma no Hodgkin (LNH) [odds ratio (OR) = 1.29, IC 95% = 1.16-1.43, valor P <0.0001], linfoma de zona marginal (MZL) (OR = 1.88, IC del 95% = 1,38-2,57) y linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) (OR = 1,34, IC del 95% = 1,12-1,61) en pacientes mayores de 65 años con EM / SFC ( 15 ). El estado de inmunidad celular activada crónicamente que ha sido reportado por varios laboratorios podría explicar plausiblemente esta asociación.

El propósito del presente estudio fue utilizar un enfoque integral de perfil inmune para determinar si un perfil anormal de citocinas circulantes podría identificarse en pacientes con EM / SFC y si este perfil se correlacionaba con la gravedad de la enfermedad y / o la duración de la fatiga.

Resultados
Demografía básica.
Los pacientes ME / CFS y controles sanos tenían una edad comparable (49.9 y 50.1 y, respectivamente) y distribución por sexo (76.6 y 77.3% mujeres, respectivamente) como se esperaba del diseño de edad y sexo ( tabla 1 ). El grupo de pacientes ME / CFS tuvo una mayor proporción de individuos caucásicos (91.7%) en comparación con los controles sanos (71.2%; P<0.0001). Datos de carrera faltaban para 10 participantes. Seis de los diez participantes para quienes faltaban datos de raza eran casos de EM / SFC, y cuatro eran controles. Los seis pacientes con EM / SFC no difirieron de los 186 casos de EM / SFC incluidos en el estudio. Los cuatro controles no difirieron de los 388 controles incluidos en el estudio. Debido a la falta de datos de raza, estos 10 participantes fueron excluidos del análisis de citocinas, lo que arrojó un tamaño de muestra final de 574 individuos.

Los hallazgos de citocinas presentados en esta sección son solo aquellos que siguen el ajuste apropiado para la unión no específica. Estos análisis se realizaron por separado por citoquinas. La intensidad de fluorescencia media preprocesada de citocinas (pMFI) se modificó según la edad, el sexo, la raza y la unión inespecífica. Además, en esta sección solo se informan los hallazgos que fueron estadísticamente significativos después del ajuste para las comparaciones múltiples [control de la tasa de descubrimiento falso (FDR) al 5%].

Análisis de casos ME / CFS vs. Controles saludables.
Se descubrió que la pMFI promedio de dos citoquinas era significativamente diferente en pacientes con EM / SFC y en controles sanos. TGF-β ( p = 0,0052) fue elevado en pacientes con EM / SFC, y la resistencia ( p = 0,0052) fue menor ( tabla 2 ). Además, tres citoquinas fueron significativamente diferentes en casos y controles cuando se estratificaron por gravedad, como se muestra en la Fig. 1 (corchetes rojos). El promedio pMFI de IL-13 fue significativamente mayor en el grupo severo ( P = 0.0250) que en los controles; la leptina fue significativamente menor en el grupo leve ( P = 0.0495), y la resistina fue significativamente menor en los grupos leves ( P = 0.0370) y severos ( P = 0.0208) (Tabla 3 ).

Análisis de los casos de ME / CFS por gravedad de la enfermedad.
En general, se encontró que 17 citocinas tenían una tendencia lineal ascendente estadísticamente significativa en la secuencia de severidad ME / CFS leve, moderada y severa: CCL11 ( P = 0.0069), CXCL1 ( P = 0.0266), CXCL10 ( P = 0.0100), G-CSF ( P = 0.0110), GM-CSF ( P = 0.0063), IFN-γ ( P = 0.0101), IL-4 ( P = 0.0103), IL-5 ( P = 0.0073), IL-7 ( P = 0.0063), IL-12p70 ( P = 0.0069), IL-13 ( P = 0.0069), IL-17F ( P = 0.0103), leptina ( P = 0.0100), factor inhibidor de leucemia (LIF) ( P= 0.0100), factor de crecimiento nervioso (NGF) ( P = 0.0069), factor de células madre (SCF) ( P = 0.0145) y TGF-α ( P = 0.0367) ( Fig. 2 y Tabla 4 ). La molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) y la resistina mostraron una tendencia estadísticamente significativa, no lineal e invertida ( P = 0,0334 para cada uno) ( figura 1 ).

Análisis de los casos de ME / CFS por fatiga Duración.
En los análisis de correlación de Spearman, antes de controlar las posibles variables de confusión, se encontró que varias citocinas se correlacionaban inversamente con la duración de la fatiga: Oncogene-α relacionado con el crecimiento (GRO-α o CXCL1), IFN-β, IL-1α, IL-1RA, IL- 2, IL-8, IL-15, TGF-α y TGF-β ( Apéndice SI , Materiales y Métodos SI y Tabla S1 ). Después de la corrección por edad, unión inespecífica, raza y sexo, solo una citoquina, CXCL9 (monokine inducida por interferón-γ, MIG), se correlacionó inversamente con la duración de la fatiga (no ajustada para comparaciones múltiples, P = 0.0123) ( Apéndice SI , Tabla S1) Aunque se esperaba que la inclusión de la duración de la fatiga como una covariable adicional resultara en una pérdida de poder estadístico, el análisis de regresión por gravedad y duración de la fatiga reveló que la tendencia lineal ascendente a través de la gravedad de la enfermedad se mantuvo estadísticamente significativa para CCL11, CXCL10, G-CSF , GM-CSF, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12p70, IL-13, IL-17F, leptina, LIF, NGF, ICAM1 y resistina. Los hallazgos por severidad para CXCL1, SCF y TGF-α se desplazaron ligeramente por encima del umbral de significación estadística (CXCL1, P ajustado = 0,0536; SCF, P ajustado = 0,0531; TGF-α, P ajustado = 0,0797), posiblemente debido a la varianza. inflación ( 18) por la covariable independiente de la duración de la fatiga. Solo CXCL9 e IL-1α se correlacionaron inversamente con la duración de la fatiga, pero perdieron significación estadística después de la corrección para comparaciones múltiples ( Apéndice SI , Tabla S2 ). También comparamos los niveles medios de citoquinas en los casos con una duración de fatiga ≤3-y ( n = 30) y aquellos con una duración de fatiga> 3-y ( n = 156), según Hornig et al. ( 17 ) No encontramos ninguna citoquina significativamente diferente entre estos dos grupos ( Apéndice SI , Tabla S3 ).

Discusión
Cincuenta y un citocinas séricas se midieron en un estudio transversal de 186 pacientes ME / SFC y 388 controles sanos emparejados por edad y sexo. Se obtuvo una sola muestra de suero al inicio sin ninguna estimulación física, emocional o neurocognitiva. Se encontró que solo dos citocinas eran significativamente diferentes en promedio en pacientes con EM / SFC cuando se comparaban como un grupo con controles sanos: el TGF-β estaba elevado y la resistina era más baja.

Se ha encontrado que el TGF-β está elevado en pacientes con EM / SFC en cinco de ocho estudios (63%), como se destaca en un metanálisis de Blundell et al. ( 10 ) TGF-β es una proteína de 112 aminoácidos que proporciona a las células la capacidad pleiotrópica de afectar los programas y el comportamiento de desarrollo celular, incluida la proliferación celular, la diferenciación, la morfogénesis, la homeostasis tisular y la regeneración ( 19 ). Las principales fuentes de células de TGF-β incluyen monocitos, macrófagos, células T (principalmente células T reguladoras), condrocitos y células epiteliales intestinales, que implican respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas. Dado el pleiotropismo del TGF-β y su amplia disponibilidad, su implicación en la patogénesis de condiciones aparentemente disímiles, como el síndrome de Marfan ( 20).), cáncer (tanto en control como en desarrollo) ( 21 ), fibrosis renal ( 22 ), enfermedades pulmonares crónicas ( 23 ), enfermedad hepática ( 24 ) y enfermedad inflamatoria intestinal (EII) ( 25 ) no es sorprendente. Debido a que TGF-β ha sido implicado en el desarrollo de cáncer, la elevación de esta citocina en pacientes ME / CFS mayores de 65 años de edad podría contribuir a su posible aumento de NHL y dos subtipos definidos de NHL, MZL y DLBCL, después de su ME / Diagnóstico de CFS ( 26 ). Además, aparte de ME / CFS, otros estudios han encontrado y propuesto un vínculo directo entre los niveles circulantes de TGF-β y el riesgo de NHL ( 27 , 28 ).

TGF-β, junto con IL-10, se ve principalmente como una citocina antiinflamatoria. La elevación de TGF-β en pacientes con EM / SFC puede representar una actividad reguladora negativa del sistema inmune de estos pacientes contra la inflamación incesante; si es así, sin embargo, uno esperaría que los niveles de TGF-β se correlacionen con la severidad de ME / CFS, como se observó con varias citoquinas proinflamatorias en este estudio. Alternativamente, parece que el TGF-β no siempre funciona para contrarrestar la inflamación. A pesar de la visión general de TGF-β como una citoquina inmunosupresora (antiinflamatoria), su efecto neto puede depender del medio inmunológico local en los tejidos diana y los niveles globales de TGF-β ( 29).) Por ejemplo, en pacientes con EII activa, se ha encontrado TGF-β a niveles elevados en el intestino inflamado en comparación con la mucosa no afectada por la enfermedad ( 25 ). Por lo tanto, los niveles elevados de TGF-β en pacientes ME / CFS pueden ser realmente perjudiciales y pueden ser un factor importante para promover la inflamación implacable y un medio "fibrótico" resistente a las intervenciones terapéuticas en algunos pacientes ME / CFS.

Resistin es una citoquina producida principalmente por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en humanos y por adipocitos (es decir, como una adipocitoquina) en roedores ( 30 ). La resistencia en humanos parece tener un papel proinflamatorio significativo al dirigirse a PBMC, células endoteliales, células de músculo liso, plaquetas ( 30 ) y condrocitos ( 31 ) y al aumentar la liberación de IL-1β, IL-6 y TNF-α a través de la vía NF-κB ( 32 ). Se ha informado que Resistin es un marcador de inflamación en el lupus eritematoso sistémico (LES) y la enfermedad de Crohn en humanos ( 33).) No está claro en este momento por qué resistin tuvo este comportamiento inusual en nuestro estudio, aumentando con la gravedad de la enfermedad de leve a moderada, pero disminuyendo con la enfermedad de moderada a grave. Se observó una tendencia similar en otras citoquinas incluyendo ICAM1 ( Fig. 1 ). Se observa un comportamiento biológico análogo en otros procesos de enfermedad como la hepatitis, en los que las transaminasas aumentan con la gravedad de la inflamación en el hígado pero en realidad disminuyen después de un cierto nivel de gravedad como resultado del agotamiento y la incapacidad de los hepatocitos para producir estas enzimas.

Sorprendentemente, 17 citoquinas se asociaron con la gravedad en pacientes con EM / SFC. Trece de estas 17 citocinas son principalmente proinflamatorias: CCL11, CXCL1, CXCL10, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-13, IL-17, leptina, G-CSF y GM-CSF. Curiosamente, 11 (65%) de las 17 citocinas y 9 (69%) de las 13 citocinas proinflamatorias se clasifican como "tipo I" al compartir una estructura 3D similar, es decir, una estructura de paquete de cuatro hélices α. Su relación lineal con la gravedad fue estadísticamente significativa incluso después de la corrección para comparaciones múltiples, a pesar de que estas 17 citocinas no distinguían los casos de los controles en general.Figs. 1 y 2 ). Esta desregulación a extremos del rango normativo también puede explicar por qué varios estudios, incluido el nuestro, han informado pocos o ningún nivel de citoquinas que distingan los casos de EM / SFC de los controles ( 10 ). Sobre todo, sugiere que la gravedad puede ser una variable clave para el subgrupo ME / CFS. Además, los niveles de citocinas circulantes en respuesta a desencadenantes inflamatorios, como la infección, han sido reportados por varios grupos como más bajos que en los controles de algunas citocinas y más altos en otros ( 34 ⇓ - 36).) Una respuesta con niveles más bajos de citocinas puede representar un esfuerzo de regulación descendente por parte del sistema inmune en un intento de atenuar la inmunopatología más severa, lo que da como resultado una sintomatología más leve o incluso nula. Una respuesta con niveles más altos puede indicar que el sistema inmune se enfrenta a un desafío mayor que es más probable que dé como resultado inmunopatología y síntomas. Los pacientes ME / CFS en la categoría leve (con niveles de citoquina en el rango inferior) estarían protegidos de la enfermedad más grave a través de este mecanismo, mientras que aquellos en la categoría severa sufrirían en el lado opuesto del espectro. Además de una respuesta a un desencadenante inflamatorio, estos hallazgos de citoquinas asociados con la gravedad también sugieren un defecto de dosis-respuesta en el metabolismo o la excreción de citoquinas.

Una segunda paradoja aparente es más difícil de explicar: las dos citocinas que distinguieron los casos de los controles, TGF-β y resistina, no mostraron una relación lineal con la gravedad de la enfermedad. Puede ser que TGF-β y resistina contribuyan a la patogénesis de EM / SFC independientemente de la gravedad de la enfermedad.

Una de las características clínicas desafiantes de EM / SFC es la capacidad de la enfermedad de persistir durante varios años. Por lo tanto, el estado inflamatorio descrito aquí podría persistir, sin cesar, durante décadas. Las adipocinas se han propuesto como mediadores y perpetuadores de enfermedades inflamatorias crónicas ( 37 ). En este estudio, se identificaron dos adipocinas como importantes: leptina y resistina. Por lo tanto, es biológicamente plausible que los cambios en el tejido de los adipocitos (en la médula ósea y / o los tejidos periféricos) vinculados a una mayor producción de estas adipocinas puedan ser un factor en la propagación de un estado inflamatorio en ME / CFS.

En los datos presentados aquí, se encontró que la leptina se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. También se encontró una correlación significativa con la gravedad de la fatiga en un estudio longitudinal dirigido por Younger et al. ( 13 ) Además de desempeñar un papel importante en la regulación del peso corporal mediante la promoción de la saciedad y el aumento del consumo de energía, la leptina se ha identificado como una citocina proinflamatoria importante implicada en respuestas inmunitarias innatas y adaptativas ( 38 ). Además, se ha demostrado que la leptina está involucrada en el reclutamiento de neutrófilos, activación de macrófagos, fagocitosis, activación de células NK, supervivencia de células dendríticas, inclinación de las células T hacia un fenotipo proinflamatorio y Th1, y que actúa como un regulador negativo de las células T reguladoras ( 38 , 39) Dos características clínicas adicionales en EM / SFC podrían explicarse por los niveles de leptina en nuestros pacientes. El EM / SFC ocurre con mayor frecuencia en mujeres que en hombres ( 2 ). Los niveles de leptina son más altos en las mujeres que en los hombres, incluso cuando se corrigen por variables de confusión como el índice de masa corporal (IMC) o el nivel de adiposidad ( 40 , 41 ), y por lo tanto, algunos sugieren que la leptina puede desempeñar un papel en la influencia del sexo el desarrollo de enfermedades, incluidas la esclerosis múltiple y el LES, que afectan predominantemente a las mujeres ( 37 ); ME / CFS puede ser otra de esas enfermedades. Además, los pacientes con EM / SFC a menudo se quejan de síntomas cognitivos y neurológicos significativos, y un estudio reciente sugirió que la neuroinflamación podría ser una característica central de la enfermedad (42 , 43 ). Recientemente, las adipocinas se han invocado como mediadores de una diafonía continua entre el tejido adiposo y el SNC que, en ocasiones, después de un desencadenante desconocido, puede dar lugar a neuroinflamación y enfermedades neurodegenerativas ( 44 ). También se ha informado recientemente que la leptina regula positivamente el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro en un modelo murino de sepsis inducida por la administración sistémica de LPS, proporcionando otro mecanismo plausible para su capacidad de causar neuroinflamación ( 45 ). Por lo tanto, es posible que las anomalías del SNC observadas en pacientes con EM / SFC puedan explicarse, al menos en parte, por la capacidad de la leptina y la resistina para cruzar y / o romper la barrera hematoencefálica ( 46).) Además, la inflamación sistémica, como la que se encuentra en nuestros pacientes, se ha invocado como un mecanismo para la neuroinflamación en otros modelos de enfermedades neurodegenerativas ( 47 ⇓ - 49 ). En modelos animales, se ha demostrado que la administración sistémica de LPS solo produce neuroinflamación ( 45 , 50 ).

Recientemente, Hornig et al. ( 17 ) informaron un grupo de citoquinas que se correlacionaban inversamente con la duración de la fatiga, y en nuestro ensayo de citoquinas investigamos las mismas 51 citoquinas. En nuestro estudio, varias citocinas [GRO-α (CXCL-1), IFN-β, IL-15, IL-1A, IL-1RA, IL-2, IL-8, TGF-α y TGF-β] también inversamente correlacionado con la duración de la fatiga antes de controlar las posibles variables de confusión (edad, unión no específica, raza y sexo). Después de la corrección por edad ( Apéndice SI , Fig. S3), unión inespecífica y raza, solo una citocina, CXCL9, correlacionada inversamente con la duración de la fatiga. Cuando se realizó el análisis de la gravedad de la enfermedad y la duración de la fatiga, los resultados de la gravedad de la enfermedad se mantuvieron estadísticamente significativos para la mayoría de las citoquinas, mientras que los de la duración de la fatiga no lo hicieron. Es posible que la duración de la enfermedad y la gravedad interactúen en su asociación con la expresión de citoquinas. Para evaluar esa posibilidad para cada citocina por separado, ajustamos un modelo de regresión que permite que los niveles medios de expresión de citocinas varíen de manera flexible sobre la distribución 2D de las puntuaciones totales de la evaluación del inventario de fatiga multidimensional (MFI-20) de la gravedad de la enfermedad ( 51 ) y la duración de la fatiga en años ( 52) Este análisis no encontró evidencia de que la relación entre la expresión media de citoquinas y la gravedad de la enfermedad cambie con la duración de la enfermedad ( Apéndice SI , Tabla S4 ). La importancia de analizar los datos ME / CFS por gravedad se ve respaldada por la falta de correlación entre la duración de la fatiga y la gravedad de la enfermedad ( Apéndice SI , Fig. S4 ). Sin embargo, la falta de correlación observada entre la duración de la enfermedad (fatiga) y los niveles de citocinas puede deberse a la menor potencia estadística del estudio actual, debido a los tamaños de nuestra muestra general de casos ( n = 186) y, especialmente, de los casos con ≤3-y duración de la fatiga ( n= 30), eran más pequeños que los estudiados por Hornig et al. Por lo tanto, nuestro fracaso para descubrir cualquier diferencia entre la duración corta y larga no nos permite descartar definitivamente la posibilidad de que los niveles séricos promedio puedan diferir entre estas dos categorías específicas de duración de la fatiga (≤3 y vs.> 3 y). Un estudio de Landi et al. ( 53 ) midieron 31 citocinas en 100 pacientes con EM / SFC con enfermedad de "larga duración" y en 79 controles sanos y observaron reducciones en los niveles de IL-16, IL-7 y VEGF-A en pacientes con EM / SFC. El suyo es el primer estudio ME / CFS para medir IL-16. Aunque Landi et al. el estudio no se ajustó a la gravedad de la enfermedad, los autores concluyeron mediante técnicas de análisis de datos multivariados que la IL-16 podría ser un candidato importante para un perfil de biomarcadores en EM / SFC ( 53).) Desafortunadamente, nuestro ensayo de citocinas no incluía IL-16.

En nuestro estudio se encontró una unión inespecífica en el sistema Luminex 200 IS que potencialmente afecta las señales de pMFI de algunas citoquinas ( Apéndice SI , Materiales y Métodos de SI ). Este descubrimiento fue posible a través del análisis de datos residuales que generalmente se consideran inconsecuentes en la mayoría de los estudios. El ajuste para la unión inespecífica se aplicó a las 51 citoquinas de todos los participantes y fue significativo para algunas de las citocinas (p. Ej., IFN-β) ( Apéndice SI , Fig. S2) Este ajuste permitió a nuestro estudio disminuir el ruido y, creemos, producir datos que pueden estar más cerca de los fundamentos biológicos reales de ME / CFS. Los ensayos multiplex que permiten la medición de un número significativo de analitos, en contraste con los ensayos que miden solo unos pocos analitos, son una herramienta eficiente para avanzar en nuestra comprensión de los procesos de enfermedad. Sin embargo, las trampas como esta para la unión inespecífica deben anticiparse y, si se encuentran, corregirse.

Las limitaciones de nuestro estudio incluyen el diseño de corte transversal. Los estudios longitudinales futuros son necesarios para abordar si los pacientes con EM / SFC permanecen dentro de la firma de su citoquina y la categoría de gravedad de la enfermedad a lo largo del tiempo o fluctúan entre ellos. Se tomaron muestras solo de sangre periférica y no de otros compartimentos como el líquido cefalorraquídeo (LCR). Los estudios de citoquina en el LCR de pacientes con EM / SFC han informado anormalidades a pesar de que el tamaño de la muestra ha sido modesto y no se analizaron muestras de suero simultáneas ( 54 , 55 ). En un estudio, se encontraron diátesis de respuestas alérgicas e inflamatorias en el LCR, similares a algunos de nuestros hallazgos, en estos pacientes ( 54 , 55).) Además, dado que la resistina y la leptina son adipocinas importantes, la corrección del IMC de los pacientes hubiera sido ideal. Sin embargo, esta corrección no fue posible con el conjunto de datos actual. Los hallazgos en este estudio proporcionan evidencia adicional de que ME / CFS probablemente involucra un proceso inflamatorio sistémico ( 17 ). Estos hallazgos también respaldan la verosimilitud biológica de la propensión de estos pacientes a experimentar varias manifestaciones clínicas importantes y en curso, ofrecen un mecanismo para la predilección de la enfermedad para afectar a las mujeres y el mayor riesgo de desarrollo de LNH, y respaldan la idoneidad de explorar la inmunomodulación como principal o terapia adyuvante ( 56 , 57) La investigación futura de citoquinas en la sangre periférica de pacientes con EM / SFC debería abarcar diseños longitudinales y buscar correlaciones con estudios de neurorradiología, neuroinflamación y LCR. Si se utilizan tecnologías basadas en matrices múltiples, los investigadores deben prestar atención a los datos residuales en el análisis de regresión para identificar y corregir los factores de confusión no reconocidos, como el enlace no específico.

Materiales y métodos
Diseño del estudio.
En la Universidad de Stanford se realizó en 2009 un estudio transversal de casos y controles emparejado por edad y sexo para investigar el papel de las respuestas inmunes, la predisposición genética y la infección en EM / SFC. Un total de 192 casos ME / SFC y 392 controles sanos se incluyeron en este análisis. Sin embargo, el tamaño final de la muestra fue de 186 casos de ME / SFC y 388 controles sanos debido a la falta de información de la raza en seis casos de EM / SFC y cuatro controles sanos. Además del suero analizado en este informe, se recogieron otras muestras de sangre periférica de estos individuos y se almacenaron para estudios inmunológicos, genéticos y de descubrimiento de patógenos en curso y futuros. Cada participante del caso se emparejó con dos participantes de control por sexo y edad (± 6 meses). Para ser incluidos en el estudio, los participantes debían tener 14 años o más, residir en el norte de California,3 ). Es de destacar que los síntomas como el sueño no reparador, el malestar postextraordinario y la memoria alterada (también denominada "niebla mental") estuvieron presentes en 96.9, 96.9 y 95.8% de los pacientes con EM / SFC, respectivamente ( Tabla 1 ). Los controles en el estudio fueron elegibles si no tenían antecedentes de fatiga y no cumplían con la definición de caso de ME / CFS. Los criterios de exclusión para ambos grupos incluyeron morbilidades activas o no controladas que habrían interferido con la capacidad del paciente para participar en el estudio, particularmente condiciones o medicamentos que causan inmunosupresión o inmunodeficiencia (se proporcionan criterios de exclusión adicionales en el Apéndice SI , SI Materiales y Métodos ).

Los participantes fueron reclutados del 2 de marzo de 2010 al 1 de septiembre de 2011, y su sangre periférica se extrajo entre las 8:30 AM y las 3:30 PM del día de la inscripción. Las muestras de sangre que incluían suero, plasma, ADN de sangre completa y ARN de sangre completa (recogidas en tubos de PAXgene) y PBMC se obtuvieron y procesaron el día de la inscripción por el Stanford Center for Clinical and Translational Research and Education ( spectrum.stanford. edu / accordions / clinical-and-translational-research-unit ) y fueron almacenados el mismo día por el Stanford Human Immune Monitoring Center (HIMC: iti.stanford.edu/himc.html ).

La edad, el sexo y la edad de inicio de EM / SFC de los participantes se registraron al inicio del estudio. El MFI-20, un cuestionario de 20 ítems ( 51 ), se administró a cada participante el día de la toma de muestras de sangre. Una puntuación más alta indica una mayor gravedad. Este instrumento ha sido validado en la población ME / CFS ( 58 ).

Ensayo de citoquinas.
Se midieron las citoquinas para cada participante en el suero usando una matriz de múltiplex 51 en el sistema Luminex 200 IS (Affymetrix) realizado en el Stanford HIMC. Se siguió el protocolo del fabricante, con las variaciones descritas por Brodin, et al. ( 59 )

Se usaron un total de 19 placas. Se ingresó la muestra de cada participante en dos pocillos replicados, y se combinaron conjuntos de casos ME / SFC y controles sanos en todas las placas para reducir el estado de confusión con los artefactos en las placas. Los resultados se aceptaron como definitivos (569 muestras) si más del 95% de los datos tenían un coeficiente de variación (CV) <10%. Cuando el CV excedió el 30% (15 muestras), el promedio sobre los pocillos duplicados redujo la varianza técnica en las intensidades de fluorescencia mediana (IF) en dos veces.

Cada placa también contenía dos pocillos de control interno y pocillos para dar cuenta de la unión genérica a las perlas (CHEX1, CHEX2, CHEX3, CHEX4) no relacionadas con la citocina diana. Las perlas Assay CheX (Radix BioSolutions) son una mezcla de cuatro perlas de control de calidad que se introducen en cada pocillo de un inmunoensayo Luminex. Cada una de las cuatro cuentas monitorea una parte del proceso de ensayo: rendimiento del instrumento, aplicación de anticuerpos de detección, aplicación de indicador fluorescente y unión no específica. El último parámetro se controla mediante las cuentas CHEX4, que tienen una fluorescencia intrínseca muy baja. La fluorescencia de CHEX4 elevada es indicativa de muestras que contienen altos niveles de actividad de unión no específica.SI Apéndice , Fig. S1 ) del análisis de regresión. THH descubrió que estos datos residuales contenían la estructura recuperable por métodos estadísticos multivariados. Posteriormente, descubrió que esta "estructura residual" estaba fuertemente correlacionada con la unión inespecífica y que la unión inespecífica se correlacionaba con la pMFI en muchas citoquinas y con el estado del caso. Por lo tanto, la unión no específica se incluyó como covariable para evitar la introducción de sesgo ( 60 ).

Luminex mide las IF de las citocinas y produce una distribución de típicamente 200-300 IF por pocillo. Calculamos las IF medias para cada distribución por pozo. Debido a que la muestra de cada participante se ingresó en dos pocillos, se calcularon dos IF medianas por citocina para cada participante. Para las IF medias que tenían recuentos de cuentas de al menos 90, calculamos el valor medio de las dos IF medias.

Análisis estadístico.
Preprocesamiento
El preprocesamiento constante a través de las citoquinas facilitó su comparación e interpretación biológica. Los datos de las IMF fueron preprocesados ​​(pMFI) para cada citocina a través de una secuencia de promedios sobre pozos duplicados, transformación de logaritmo natural para reducir la heterogeneidad de la varianza, aislamiento y eliminación de los efectos de las placas, y centrado y escalado. El uso de medias marginales de población ( 61 ) ajustadas por covariables de edad, sexo y raza (blanco vs. no blanco) permitió la estimación y eliminación por resta de efectos de placa que fueron equilibrados (es decir, 1: 1 en lugar de 2: 1) con respecto para controlar contra el estado del caso. Centrar y escalar implicaba restar la media de la muestra y dividir por la muestra SD.

Análisis primario: gravedad de la enfermedad.
A priori, los casos se clasificaron en terciles para la severidad ME / CFS: los puntajes MFI-20 de 51-75 se clasificaron como enfermedad leve, los puntajes de 76-85 como enfermedad moderada y los puntajes de 86-100 como enfermedad grave. Para cada citoquina, se utilizó la estimación de entropía máxima generalizada (GME) ( 62 ) para ajustar un modelo de regresión para probar hipótesis con respecto a los cuatro medios pMFI (control y tres severidades). Específicamente, hicimos una regresión de pMFI en la categoría de gravedad de la enfermedad (control, leve, moderado y grave), sexo, raza, edad, pMFI del control de unión no específica (CHEX4) (para obtener más información sobre unión inespecífica, consulte el Apéndice SI , SI Materiales y Métodos), y, para permitir la posibilidad de que los efectos de las covarianzas difieran entre los casos y los controles, los términos de interacción entre el estado del caso y cada covariable (sexo, raza, edad y pMFI del control de unión no específico). [También realizamos un análisis de regresión de modelo mixto lineal que, además de estas covariables, se ajustó para el conjunto combinado como un coeficiente aleatorio para dar cuenta de cualquier estructura restante causada por el proceso de coincidencia. El conjunto combinado explicó ~ 0% de la varianza en los niveles de citocinas para casi todas las citocinas (en presencia de otras covariables) y no se retuvo en los resultados presentados aquí.] Usando el ajuste de los datos de pMFI a este modelo de regresión, prueba de hipótesis se usó para comparar medias pMFI ajustadas por covariables entre ( i ) cada grupo de gravedad de enfermedad versus control y ( ii)) el promedio igualmente ponderado en los tres grupos de gravedad versus control. Para comparar los controles con los casos en general, las covariables se mantuvieron en sus valores medios de muestra para los casos. Para comparar los controles con cada caso específico, el nivel de gravedad, las covariables se mantuvieron en sus valores medios de muestra para el nivel de gravedad de ese caso específico. Además, en análisis post hoc, el ajuste de los datos pMFI a este modelo de regresión se utilizó para examinar la asociación entre la respuesta media de citoquinas y el nivel de gravedad dentro de los casos. Específicamente, probamos las tendencias lineales y curvilíneas en los medios pMFI a lo largo de la secuencia de enfermedad leve, moderada y grave. Las formas de las distribuciones de muestra de los valores de pMFI en individuos de esta muestra variaron ampliamente entre las citoquinas.62 ). Se proporcionan más detalles técnicos sobre la aplicación de GME en el Apéndice SI , Materiales y Métodos de SI .

Análisis secundario: duración de la fatiga.
En un análisis limitado a casos, regresamos la IFMF en la categoría de gravedad de la enfermedad (leve, moderado y grave), sexo, raza, edad, IFMp del control de unión no específica (CHEX4) y la covariación adicional de duración de la fatiga (en años) . Dado que permitimos que los efectos de las covarianzas difieran entre los casos y los controles en el análisis primario, los modelos de regresión para los casos son idénticos para los análisis primarios y secundarios, con excepción de la duración de la fatiga que sirve como covariable en los análisis secundarios. Con modelos de regresión primarios y secundarios que de otro modo serían idénticos, el análisis secundario pudo aislar el efecto de la duración de la fatiga en pMFI. [Para examinar la solidez de los hallazgos en el método de estimación de parámetros, además de GME, también ajustamos los modelos de regresión a los datos de pMFI usando mínimos cuadrados ordinarios (MCO). Un método OLS (o estrechamente relacionado) fue utilizado en un informe previo por Hornig et al. (17 ). Los resultados informados aquí son similares para los métodos de regresión GME y OLS y están disponibles a pedido. Se proporcionan más detalles técnicos sobre la aplicación de OLS en el Apéndice SI , Materiales y Métodos de SI .] Para permitir la comparación directa con otro informe reciente ( 17 ), calculamos las estimaciones de los coeficientes de correlación de rangos de Spearman entre pMFI de cada citoquina y la duración de la fatiga, y llevó este análisis un paso más allá ajustando las estimaciones de los coeficientes de correlación de rango de Spearman para edad, unión no específica, raza y sexo. Se proporcionan más detalles técnicos en el Apéndice SI , Materiales y Métodos SI .

Tipo I de control de errores.
En todo momento, los valores de P se han ajustado para tener en cuenta la acumulación de errores de tipo 1 en múltiples pruebas de hipótesis. Específicamente, los ajustes de valor de P usaron un procedimiento de incremento lineal adaptativo de dos etapas para controlar el FDR al 5% ( 60 , 63 ) a través de las 51 citoquinas. El control FDR se realizó por separado por grupo (p. Ej., Nivel de gravedad) para permitir diferencias grupales en las proporciones de hipótesis verdaderamente nulas. Todos los análisis se realizaron en SAS 9.4 (SAS Institute) y R 3.2.2 a 3.3.2 ( https://www.R-project.org/ ).

Expresiones de gratitud
Agradecemos a los pacientes con EM / SFC que se ofrecieron como voluntarios y participaron en nuestros estudios; el Stanford Institute for Immunity, Transplantation and Infection y el Stanford Human Immune Monitoring Center por apoyo; Dr. Manisha Desai y Aya Mitani en la Unidad de Ciencias Cuantitativas del Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, por su trabajo inicial y análisis de nuestros datos, lo que refuerza la solidez de nuestros hallazgos; Donn W. Garvert, MS, Programador estadístico (Stanford ME / CFS Initiative); y Ben B. Varasteh (El Centro de Stanford para Investigación y Educación Clínica y Traslacional) y Jane Norris, PA, para esfuerzos de reclutamiento de pacientes.

[elipoarch]

Me pasan este vídeo de Montoya (en castellano) al respecto.
Gracias Kali!

https://www.youtube.com/watch?v=Vo8rhWXZysA

[coco]

Ole Montoya!

Tengo un sueño como decía aquel. Que algún día un médico en España nos trate de verdad de una manera GLOBAL y sin miedo, sin tomarnos el pelo.

Dr Kauffman, Klimas, Montoya...